用于例如细胞裂解的脉动压力波的产生的制作方法

专利名称：用于例如细胞裂解的脉动压力波的产生的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种方法，通过该方法受控热源(优选激光)在封闭液体中产生脉动蒸汽泡。脉动速率(频率)优选在超声区域内并具有很大的压力，借此在液体中出现空化作用(cavitation)。所述空化作用的结果是引起悬浮成分例如细胞或细菌芽孢破裂。细胞成分的超声破裂公知为通过超声波裂解。
背景技术：
当测试生化成分例如细胞或细菌芽孢时，感兴趣的物质(例如DNA、RNA、血红蛋白、蛋白质等)必须从所述细胞或芽孢中提取出来，感兴趣的物质包含在细胞或芽孢中，因此屏蔽化学药物、酶的直接进入或者直接测量。破裂细胞膜或细菌芽孢壁的方法公知为裂解(lysing)。裂解的方法之一为施用裂解剂，能化学裂解打开或溶解所述膜或壁。其他方法包括机械法如研磨(例如“弗氏压碎器”)或反复冻融，反复冻融中的结晶作用会导致细胞壁物理破裂。
一种常用的裂解方法为超声法。超声法包括将悬浮液中的细胞或芽孢暴露于超声。细胞或芽孢悬浮在其中的液体介质(多数通常为含水的)充当超声能的载体。如果相关的压力数值大，会在液体中产生空泡。空化作用包括高压微泡的形成-分别溃灭。微泡的形成和随后溃灭将引起液体介质中的溃灭剪切力，并且同样地存在于这里所包含的细胞或芽孢周围，最后破坏打开膜及壁，并游离内容物。

发明内容
本发明的目的是提供一种在液体中产生脉动压力波(PPW)的方法，使用内在产生换能器，即无需与外在PPW换能器(例如外在超声波聚能器(ultrasound horn)或压电换能器)具有机械界面，所述液体可以包含于微通道(micro channel)或微室(micro chamber)。
本发明的另一目的是提供一种在液体中产生PPW的方法，所述液体可以包含于微通道或微室，所述PPW引起液体中的空化作用。
本发明的又一个目的是提供裂解液体中一个或多个细胞的方法，所述液体可以包含于微通道或微室。
本发明的再一个目的是提供解聚集液体中一个或多个细胞的方法，所述液体可以包含于微通道或微室。
本发明的进一步的目的是提供一种裂解细胞的简单方法，优选还能与分析裂解细胞成分的下一个步骤兼容或对该步骤有贡献的方法。
本发明的进一步的目的是提供产生液体中局部的(即空间限制的)PPW的方法，例如获得局部空化作用和/或细胞的局部裂解；或者获得微粒的局部解聚集。
当阅读说明书和实施例时，本发明的其他目的变得显而易见。
因此，本发明的一个方面涉及在液体中产生脉动压力波(PPW)的方法，该方法包括如下步骤a)提供加热装置，b)用该加热装置加热一部分液体，以使液体的该部分蒸发，由此形成蒸汽泡，c)或者部分冷凝或者全部冷凝蒸汽泡，以及d)重复步骤b)和步骤c)。
优选所述PPW为超声波。
本发明的另一个方面涉及在液体中裂解生物细胞的方法，该方法包括在液体中产生脉动压力波(PPW)。
本发明的又一个方面涉及在液体中解聚微粒的方法，该方法包括在液体中产生脉动压力波(PPW)。


在本发明以下一些实施方式中将对照附图描述，图1表示本发明的优选实施方式，其中激光能被控制在含有液体介质的局限内；图2表示使用了包被加热原件的实施方式，以及；图3表示加热器/激光循环以及产生20kHz超声波的示例性操作方式中结果泡形成和消失的时间图。
具体实施例方式
本发明的一个方面涉及在液体中产生脉动压力波(PPW)的方法，该方法包括如下步骤a)提供加热装置，b)用所述加热装置加热一部分液体，以使液体的该部分蒸发，由此形成蒸汽泡，c)冷凝该蒸汽泡，以及d)重复步骤b)和步骤c)。
在本发明的优选实施方式中，所述PPW为超声波。
所述PPW可以在多种液体中产生。例如，所述液体可以包括选自由水、二甲亚砜、丙酮和醇所组成的组中的溶剂。
并且或者可选地，所述液体可以例如包括非极性溶剂例如苯、甲苯、二甲苯、庚烷、辛烷和它们的混合物。
所述醇可以例如选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇所组成的组。
在本发明优选实施方式中，所述液体包括至少10％(w/w)的水例如至少50％(w/w)或75％(w/w)，进而优选至少90％(w/w)的水。
所述液体可以例如包括样品，诸如全血、血清、血浆、唾液、尿、组织或者它们的成分。
在本发明的一个实施方式中，所述液体为用水性溶液稀释的全血。
在本发明的优选实施方式中，所述液体为脱气液体，例如脱气的水。脱气液体可以是例如每千克液体包括至多15mg溶解的气体，例如至多10mg、5mg、3mg、2mg、1mg、0.5mg、0.1mg，或者0.05mg，例如至多0.01mg。例如，脱气水性液体可以是例如每千克水性液体包括至多15mg溶解的气体，例如至多10mg、5mg、3mg、2mg、1mg、0.5mg、0.1mg，或者0.05mg，例如至多0.01mg。
所述液体可以包括一种或多种添加剂。所述一种或多种添加剂可以例如选自由去污剂、防腐剂、pH缓冲液、盐和水溶性聚合物所组成的组。
所述去污剂可以例如选自由吐温20、乙基苯基聚乙二醇(NP 40)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CHAPS、CHAPSO和十二烷基硫酸钠(SDS)所组成的组。
所述防腐剂可以为例如叠氮化钠。
所述pH缓冲液可以例如选自由磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3-吗啉基丙磺酸(Mops)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES buffer)所组成的组中。
所述盐可以例如选自由MgCl2、NaCl、KCl、谷氨酸钠和谷氨酸钾所组成的组。
所述水溶性聚合物可以为例如聚乙二醇(PEG)和/或聚乙烯醇(PVA)。
更多有关信息以及相关添加剂实例可以在Sambrook等人的或其他本领域技术人员公知的一般教科书中找到。
用在上下文“X和/或Y”中的名词“和/或”应该解释为“X”或“Y”或者“X和Y”。
在本发明的一个优选实施方式中，所述液体例如水性液体的平均温度，在产生PPW过程中温度范围为-10℃至120℃，例如0℃至100℃、10℃至80℃和20℃至60℃。在一个优选实施方式中，所述液体温度范围为60℃至80℃，更优选范围为65℃至75℃，例如约71℃。应当注意的是，虽然所述液体的平均温度具有代表性的范围为-10℃至120℃，但是可以存在具有更高温度的部分液体，例如，由于通过加热装置加热和/或由于由PPW引起空化作用。
在本发明的一个实施方式中，在步骤b)和c)中蒸发和部分或全部浓缩的部分液体，各自表现为液体总质量的小百分率。所述部分液体可以为例如该液体总质量的至多1％，例如至多0.5％、0.1％或0.05％，或者优选是该液体总质量的至多0.01％，例如至多0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％，例如至多0.000005％。
在本发明一个优选实施方式中，通过膜状沸腾蒸发所述部分液体。膜状沸腾的产生可以是通过充分快速加热部分液体，以使部分液体的蒸发几乎瞬间完成，例如至多500μs或者优选至多100μs、50μs、10μs或5μs，例如更优选至多1μs、0.1μs或0.01μs。快速蒸发通常形成保护性蒸气层，用以保护剩余部分的液体避免受热。优选地，在0.1μs至100μs范围内完成部分液体的蒸发。
在本发明优选实施方式中，所述液体接触壁的壁表面。所述壁可以例如形成包含该液体的容器的一部分。所述容器可以例如为微室或微通道。
微室通常具有至多100μL的容积，例如至多50μL、10μL、5μL、1μL、100nL、或10nL，例如至多1nL的容积。可以预期更小的微室容积。例如微室可以具有至多100pL的容积，例如至多50pL、10pL、5pL或1pL，例如至多0.1pL的容积。优选所述微室具有至多10nL的容积，更优选所述微室通常具有至多1nL的容积。
在pepi中，所述微室具有0.1pL至100μL范围的容积，优选10pL至1μL范围，更优选100pL至10nL范围，例如0.5nL、1nL或5nL。
所述微室可以包括一个或多个开口，其例如可以连接到一个或多个微通道。
微通道通常具有至多500μm的横截面尺寸，例如至多250μm、150μm、100μm、75μm、50μm、25μm或15μm，例如至多5μm。优选地，所述微通道具有至多100μm的横截面尺寸，更优选所述微通道具有至多50μm的横截面大小。微通道可以具有不均匀尺寸，例如100μm的宽度和50μm的深度。
许多类型的加热方式可以用于加热所述部分液体。例如加热方式可以选自由加热元件和电磁辐射所组成的组。
所述加热元件可以为例如欧姆加热元件，例如电阻器，或者液体的部分，例如所述液体具有电流传导性质。
所述加热元件可以例如位于接触液体的壁表面或者位于壁中。
在优选实施方式中，所述加热元件为微型。例如，优选加热元件的最大尺寸为至多1000μm，例如至多1000μm、500μm、250μm、150μm、100μm或50μm，例如至多25μm。
在本发明优选实施方式中，所述电磁辐射为电磁辐射束，例如聚焦束，诸如聚焦激光束。
所述电磁辐射通常通过电磁辐射源提供。所述电磁辐射源可以为激光、例如气体激光器、固态激光器，诸如激光二极管(LD)，或者光源可以为发光二极管(LED)氙灯或者足够强度的任何灯丝灯泡。可以以或者脉冲方式或者持续方式操作激光器或LED，氙灯或灯丝灯泡可以使用机械阻挡或偏移方式调节。
所述电磁辐射可以例如被液体吸收或者被包括与液体接触壁表面的壁吸收。
在本发明特别优选的实施方式中，所述电磁辐射被接触液体的壁表面吸收。所述壁表面可以例如包括光吸收材料层，在该情况下，壁的剩余部分可以起到电磁辐射非吸收载体的作用。
在一个实施方式中所述容器，例如微通道和/或微室，包括透明窗，该窗对电磁辐射波长透明。当使用例如红外激光器提供的包括波长范围从700nm至3000nm的电磁辐射时，所述透明窗可以例如包括硅。所述透明窗可以例如包括可以透过可见波长范围的光的玻璃或塑料。例如可以使用红光二极管激光器，具有中心波长632nm、635nm、670nm、680nm或720nm。
所述光吸收材料可以是任何容易吸收从光源发射的光能并从而将所吸收的光转化为焦耳热的材料。一种所述材料可以是氮化铝；或者尤其当使用硅作为基底材料时，可以是掺杂硅例如硼掺杂硅或磷掺杂硅；或者在一个优选实施方式中，可以是含有提高特殊波长或多重波长吸收的添加剂的聚合物(例如来自Avecia-UK(PRO-JET830NP)、Epolin-US(EpoLightTM4121)、Clearweld-US(LD120)或Treffert-FR的商业上可获得的产品)。
光吸收材料可以形成微通道壁或微室壁的主要部分，确保壁的热阻足够低允许基本量的热被转移到微通道或微室。因此光吸收材料可以充当热板，例如在微通道内加热液体。所述光吸收材料可以吸收狭窄区域光谱，或者可以完全不通透并吸收从紫外线到中红外线的任何波长。
所述光吸收物质可以涂布、喷雾、沉积或点缀(spotted)在壁上，可以形成紧贴通道壁的层，或者吸收到通道壁中。所述微通道和/或微室可以通过第一和第二基层物质形成，所述第一基层物质包括透明窗并且所述第二基层物质包括光吸收材料。
优选选择所述光吸收材料，以使照射到壁表面的电磁辐射强度的至少1％能被吸收到光吸收材料中，例如至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或者99％，例如至少99.99％。
用加热装置加热的部分液体形成的蒸汽泡通常达到最大高度范围为1μm至200μm，优选范围为5μm至50μm，更优选范围为10μm至40，例如约25μm或约30μm。
在本发明的一个实施方式中，在每一步骤b)中形成新的蒸汽泡。可选地，当新的步骤b)开始时，得自在前的步骤c)的蒸气泡还没有完全冷凝，并且来自新步骤b)的能量向存在的蒸汽泡加入新蒸气。
通过步骤b)的加热装置加热的持续时间范围通常为0.1至100μs，优选范围为0.5至50μs，更优选范围为1至10μs。
在步骤c)中冷却蒸汽泡，从而冷凝蒸汽泡。所述蒸汽泡可以例如在步骤c)过程中完全冷凝，即所有蒸汽泡的蒸汽恢复液体形式。
蒸汽泡可以被动冷却，即加热装置的能量散逸到周围溶液中，也可以散逸到微室或微通道的壁中。可以通过使用具有高导热率的材料，例如各种金属材料和半导体，加速蒸汽泡的被动冷却。在实施方式中，优选硅为壁材料。
步骤b)的持续时间范围通常为1至100μs，优选范围为5至50μs，更优选范围为10至40μs，例如15μs、20μs、25μs、30μs或35μs。
在本发明的一个实施方式中，以固定的频率重复步骤b)和c)。
也可以以变化的频率重复步骤b)和c)。
在本发明的一个优选实施例中，重复步骤b)和c)的频率为0.5至1000kHz的范围，例如10至500kHz的范围，优选15至150kHz的范围，更优选20至100kHz或15至50kHz的范围。
新的步骤b)中，可以在先前步骤b)过程中形成先前蒸汽泡的微通道或微室中相同的位置上，形成蒸汽泡。此外，新的步骤b)中，可以在先前步骤b)过程中形成先前蒸汽泡的微通道或微室中不同的位置上，形成蒸汽泡。
新的步骤b)的新蒸汽泡可以包括与先前步骤b)的先前蒸汽泡所包括的部分液体基本相同的部分液体。可选地，新蒸汽泡可以包括除在先前步骤b)中蒸发液体外的不同部分的液体。
在本发明的一个实施方式中，所述液体流过微通道和/或微室。通常的流速范围为1pL至100μL/分钟，优选范围为1nL至10μL/分钟，更优选范围为10nL至1μL/分钟。可选地，所述液体不流过微通道和/或微室。
在一次重复中步骤b)和步骤c)的总持续时间范围通常为1μS至2mS，优选范围为2μS至100μS，更优选范围为10μS至50μS或者5μS至20μS。
在本发明的一个重要实施方式中，PPW引起液体中的空化作用。
当施用在液体上的PPW能量强度超过将液体分子结合在一起的吸引力时，产生叫做空化作用的现象。空化作用贯穿微泡内爆过程的形成、生长和溃灭一不能与蒸汽泡混淆。所述微泡的内爆产生在液体中短期存在的“热点”，可以释放足够的能量促进许多种化学反应。
空化作用的效果可以受很多因素影响，例如液体温度、PPW的强度、空化作用的持续时间以及PPW的频率。
在液体中产生空化作用的关键为克服“空化阈”，该空化阈是被引入流体中的能量强度引发微泡形成、生长和溃灭的点。然而不同的流体或液体具有不同的空化阈，只有施加的能量大于该空化阈才能促成空化作用形成。
因此，在本发明的一个优选实施方式中，蒸汽泡的尺寸和/或液体排量以及微泡形成和冷凝的速率足以在液体中产生空化作用，即蒸汽泡通过扩张各自收缩而施加在液体上的压力。
例如，当加热装置为电磁辐射束时，光斑面积、束的效果、加热的持续时间、冷凝的持续时间，以及重复的次数应当足以产生空化作用。
可选地，如果加热装置为加热元件，那么加热元件上的电压、加热的持续时间、冷凝的持续时间，以及重复的次数应当足以产生空化作用。
空化作用通常发生在蒸发的液体部分附近。在本发明的一个实施方式中，优选所述空化作用发生在离蒸汽泡外周至多5000μm的距离内，例如至多2500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm、200μm、150μm或100μm的距离内，例如离蒸汽泡外周至多50μm的距离内。
在本发明的另一实施方式中，空化作用发生在离蒸汽泡外周至少50μm的距离内，例如至少100μm、200μm、500μm、1000μm、2000μm或3000μm，的距离内，例如离蒸汽泡外周至少5000μm的距离内。
所述蒸汽泡的最大尺寸用于距离的计算。
在本发明的另一个实施方式中，所述空化作用发生在离壁表面上电磁辐射束光斑中心至多5000μm的距离内，例如例如至多2500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm或100μm的距离，例如离壁表面上电磁辐射束光斑中心至多50μm的距离内。
通常，所述空化作用发生在离壁表面上电磁辐射束光斑中心1μm至5000μm的距离范围内，例如1μm-50μm、50μm-100μm、100μm-250μm、250μm-500μm、500μm-1000μm和1000μm-5000μm的范围。优选所述空化作用至少发生在离壁表面上电磁辐射束光斑中心1μm-250μm的距离范围内，例如1μm-100μm的范围。
在本发明的另一实施方式中，所述空化作用发生在离壁表面上电磁辐射束光斑中心至少50μm的距离范围内，例如至少100μm、200μm、500μm、1000μm、2000μm或3000μm的距离内，例如离壁表面上电磁辐射束光斑中心至少5000μm的距离。
在本发明的另一实施方式中，所述空化作用发生在离加热元件中心至多5000μm的距离内，例如至多2500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm或100μm的距离内，例如离加热元件中心至多50μm的距离。
可以用许多方法检测空化作用的存在。例如可以使用敏感扩音器检测空化作用。可选地，可以使用溶解于水或甘油的空化作用示踪物例如鲁米诺(luminol)检测空化作用。当暴露于空化作用时，空化作用示踪物发光，可以通过敏感光学检测器例如光电倍增管、冷控温CCD阵列(cooled CCD array)或者雪崩二极管检测。如果加热装置为电磁辐射，可能需要滤出电磁辐射波长来检测空化作用示踪物发出的光。
有用的鲁米诺溶液可以通过将鲁米诺(西格玛化学公司，美国)溶解在二甲亚砜(西格玛化学公司，美国)中制备，浓度10-2M，在即将使用前，用含0.01M磷酸钠和0.15M氯化钠的pH 7.4的磷酸盐缓冲生理盐水将该溶液稀释至浓度为1×10-5M。
空化作用的另一指示剂为与液体接触塑料表面的物理劣化。所述劣化可以借助显微镜或扫描电子显微镜(SEM)在视觉上检测。
空化作用检测的另一方法为，将微粒例如具有约5μm直径的乳胶颗粒或者红细胞的悬浮液暴露于PPM，并通过显微镜检查所得的悬浮液。如果空化作用在所述悬浊液中发生，可以在悬浮液中找到得自受破坏的悬浮液微粒的亚微米碎片。
在本发明的一个重要实施方式中，所述液体包括微粒。例如，液体可以包括许多微粒，例如至少2个微粒、10个微粒、102个微粒、103个微粒、104个微粒、106个微粒或108个微粒，例如至少1010个微粒。所述溶液可以例如为微粒的悬浮液。
所述微粒可以包括选自由有机聚合物、金属、金属氧化物、合金、磁性材料和所述材料的组合所组成的组中的材料。所述金属氧化物可以为氧化硅例如石英或玻璃。所述有机聚合物可以选自由聚乙烯乙二醇-聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、多肽、聚乙烯、聚丙烯和聚甲基甲基丙烯酸酯(polymethamethacrylate)以及所述材料的组合物所组成的组。另外，所述微粒可以包括如上所述材料的一个或多个部分的复合材料。
所述微粒可以为例如选自由生物细胞、微小颗粒和纳米颗粒所组成的组。
所述微粒可以例如具有范围为1nm至500μm的最长横截面尺寸。所述微粒可以为纳米颗粒，即具有范围为1nm至1000nm的最长横截面尺寸，例如25nm至1000nm，或者所述微粒可以为微小颗粒，即具有范围为1μm至500μm的最长横截面尺寸。
在本发明的一个优选实施方式中，所述微粒为生物细胞。也就是说，所述液体可以含有生物细胞或生物细胞的悬浮液。
所述生物细胞可以为例如细菌，哺乳动物细胞，例如红血球细胞或白血球细胞或癌细胞。所述生物细胞还可以为细菌芽孢。
过度暴露于空化作用可以破坏生物细胞的成分，即受体、细胞器、蛋白质和遗传物质。在本发明的一个实施方式中，所述包括生物细胞的液体暴露于脉动压力波至多600秒，例如至多500秒、400秒、300秒、200秒、1 00秒、50秒、25秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、1秒、0.1秒或0.01秒，例如至多0.001秒。
在本发明的一个重要实施方式中，所述电磁辐射束为激光束。
本发明的一个实施方式中，电磁辐射束光斑最大尺寸为至多1000μm，其中所述束接触与液体接触的壁或壁表面。优选地，电磁辐射束光斑最大尺寸为至多500μm，其中所述束接触与液体接触的壁或壁表面，更优选至多300μm，例如200μm、100μm、75μm、50μm、25μm、15μm、10μm或5μm，例如至多1μm。
通常，电磁辐射束例如激光辐射的功效为1mW-200W的范围，例如在1mW-100mW、100mW-500mW、500mW-1W、1W-20W和20W-200W的范围。
或者通过在步骤b)过程中提供电磁辐射单脉冲，或者通过提供累积包含与所述单脉冲相同能量的多重短脉冲，可以完成步骤b)的加热。
所述电磁辐射可以通过激光器，例如气体激光器或者固态激光器，例如激光二极管来提供。所述电磁辐射可以由发光二极管(LED)、氙灯或任何足够强度的灯丝灯泡来提供。可以以脉冲方式或持续方式操作激光器或LED，可以使用机械阻挡或偏移方式调节氙灯或灯丝灯泡。
所述电磁辐射可以包括范围为190nm-5000nm的波长，例如190nm-400nm、400nm-700nm、700nm-1500nm，以及1 500nm-5000nm。在pepi中，电磁辐射包括范围为600nm-800nm的波长，例如631-633nm、634-636nm、669-671nm、679-81、719-721nm或806-809nm，以及例如632nm、635nm、670nm、680nm、720nm或808nm。
在pepi中，至少90％，例如至少95％或99％的电磁辐射能量由范围190nm至5000nm的波长提供，例如190nm-400nm、400nm-700nm、700nm-1500nm，以及1500nm-5000nm。在pepi中至少90％，例如至少95％或99％的电磁辐射能量由范围600nm-800nm的波长提供，例如631-633nm、634-636nm、669-671nm、679-81nm、719-721nm或806-809nm，以及例如632nm、635nm、670nm、680nm、720nm或808nm。
本发明的另一方面涉及在液体中裂解生物细胞的方法，该方法包括在液体中根据这里描述的方法产生PPW。
因此，本发明涉及在液体中裂解细胞的方法，该方法包括下列步骤a)提供加热装置，b)用该加热装置加热一部分液体，以使液体的该部分蒸发，由此形成蒸汽泡，c)冷凝该蒸汽泡，以及d)重复步骤b)和步骤c)，以形成液体中的PPW，所述PPW裂解生物细胞。
在本发明一个优选实施方式中，如这里所述，控制所述PPW以形成液体中的空化作用。
裂解生物细胞的方法或产生PPW的方法可以进一步包括以下步骤e)分析裂解的生物细胞的成分。
裂解的生物细胞成分的分析可以利用例如在PCT申请WO 2004/016948中描述的系统和方法，该申请此处并入作为参考。
裂解的生物细胞成分的分析例如可以包括电泳技术例如毛细管电泳(CE)；核酸扩增技术例如PCR；免疫测定法。这些和其它相关分析技术被Sambrook等人更详细地描述。
裂解的生物细胞成分的分析例如可以包括一种或多种光学分析方法，例如选自由紫外光谱法、可见光光谱法、近红外光谱法、红外光谱法和荧光检测所组成的组中的方法。
本发明另一个方面涉及用于液体中微粒解聚集的方法，该方法包括根据此处所述的方法在液体中产生PPW。
术语“解聚集微粒”是指打碎和/或重分散团聚的分子成为单个微粒或微粒的较小聚集体。
因此本发明涉及用于液体中微粒解聚集的方法，该方法包括如下步骤a)提供加热装置，b)用该加热装置加热一部分液体，以使液体的该部分蒸发，由此形成蒸汽泡，c)部分冷凝或者全部冷凝蒸汽泡，以及d)重复步骤b)和步骤c)，以形成液体中的PPW，所述PPW解聚集微粒。
本发明的一个特别的方面涉及在液体中产生波动压力波的方法，该方法包括以下步骤i)提供所述液体的一部分的局部加热，以使所述液体的所述部分变成蒸汽状态，所述蒸汽通过膨胀排开剩余若干体积的液体；ii)移除/关掉热源，允许产生的蒸汽冷却并冷凝和收缩；iii)以固定的频率重复步骤i)和步骤ii)；因此蒸汽泡的重复产生，所述蒸汽泡的分别溃灭，对液体介质起到振荡机械换能器的作用。当振荡的频率在超声区域(超过12-15kHz)时，在液体中产生空化作用一导致形成具有非常高内压的微泡。微泡的高压将引起悬浮在液体中的固体组分破裂。悬浮组分可以为体细胞或细菌芽孢，细胞膜-各自地-细菌外壳由于暴露于空化效应而破裂，并最终释放细胞间或芽孢间的内容物诸如例如DNA材料。
许多方法可以用于提供局部加热产生蒸汽泡。在一个实施方式中，可以放置欧姆加热元件(电阻器)直接与液体介质接触。控制电子器件将驾驭加热元件。在一个优选实施方式中，加热通过外部来源进行，定向于有意使泡形成的位置。任何形式的电磁能可以定向于所述位置。
在一个优选实施方式中，激光束定向于装有液体介质的主体的一部分，这样在需要的位置提供了集中的能量。激光能可以被吸收并在特定界面层转化成焦耳热。所述激光能还可以在液体自身中转化成焦耳热，例如使用在所述液体介质内表现高吸收度的合适的发射激光波长。所述集中的能量将加热所述位置相关的液体，引起迅速的蒸汽转换。关闭激光束会引起加热位置的快速冷却，随后形成的蒸汽泡将冷凝并溃灭。激光发射的来源可以用普通电子控制系统精确控制。所述控制系统将能控制加热脉冲周期以及间歇周期。通过所述电子控制系统可以有效实现不同频率以及脉冲操作。
用于裂解体细胞的优选操作频率为15-40kHz的区域(例如20kHz)，但是能产生较低频率(例如可听见的频率1-15kHz)和较高频率。
本发明的另一实施方式中，只在短时间内应用超声频率，随后是一定时间的非超声活动。短时间的操作将引起液体中的空化作用，但是由于随后时间的无活动，悬浮成分(例如细胞和/或细胞壁)将不会受到永久性破坏。然而所述活动将引起细胞不结块或解聚集。特别是亚微米尺寸的粉末(例如纳米粉末)当在液体中悬浮时往往结块/聚集；超声脉冲的影响将使他们解聚集。
一个优选实施方式中液体介质包含在微流体系统中，这样带有悬浮组分的液体的部分将在亚毫米尺寸的微通道或微室中经受超声波作用。如前所述，欧姆加热元件可以应用在微流体系统中。在一个优选实施方式中，软件控制的激光束定向于微通道或微室的离散位置，泡形成和破裂一各自超声波的产生一将只作用于小部分被选封闭的液体。可以从X或X-Y扫描装置(检流计)定向激光束，以便微流系统(或芯片)的任何部分可以选择性地受到激光束的影响。在一个实施方式中，激光束可以反复扫描一个区域或通道的一个长度，而如上所述持续产生超声波，因此液体的较大面积或体积能够受到超声波作用。
图1展示了本发明的优选实施方式，其中激光能定向于包含液体介质的局限。所述局限体(1)具有局限或室或通道横截面(2)。激光束(3)通过半透明体材料定向于所述室。激光能被吸收并在主体材料和液体介质界面间转化成热，导致膨胀蒸汽泡(4)的形成。所述膨胀的泡将在封闭液体介质上施加很大压力。邻近的图(5)说明的是激光脉冲(6)-激光“开时间”，随后的间歇停顿(7)-激光“关时间”。在激光“关时间”过程中，蒸汽泡得到冷却、冷凝及收缩，从而以负压作用于液体。根据说明书重复该循环，导致液体介质经历脉动压力，其频率分别与激光脉冲打开和关闭的频率相同。
图2表示使用被包住的加热元件的实施方式。局限体(1)具有局限或室或通道横截面(2)。加热元件(3)为通过导线(5)电连接于脉冲产生控制电子器件。所述加热元件根据时间图(6)分别地打开关闭。泡的产生和溃灭如上述解释(如图1下面详细的说明所述)。
图3表示在操作产生20kHz超声波的示例模式中，加热器/激光器循环和结果泡的形成和消失的时间图表。如图所示，在50μs周期过程中，激光器或加热元件活化3μs(“关时间”为47μs)。虚线说明泡的生长。所述泡将在热源消失后生长一段时期，达到最大尺寸，在此之后溃灭并恢复到其原来的液体状态。50μs周期提供得到的超声波频率为20kHz。
特别实施方式1为在液体中产生脉动压力波的方法，该方法包括i)提供所述液体的一部分的局部加热，以使所述液体的所述部分变成蒸汽状态，所述蒸汽膨胀排出若干体积的剩余液体；ii)移除/关掉热源，允许产生的蒸汽冷却并冷凝和收缩；iii)以固定的频率重复步骤i)和步骤ii)；特别实施方式2为根据特别实施方式1的方法，其中，所述局部加热由与液体无机械连接的来源提供。
特别实施方式3为根据特别实施方式2的方法，其中，所述局部加热的来源为光学束。
特别实施方式4为根据特别实施方式3的方法，其中，所述光学束为激光。
特别实施方式5为根据特别实施方式1的方法，其中，所述局部加热的来源为电力驱动的加热元件。
特别实施方式6为根据特别实施方式1的方法，其中，所述重复的频率为超声频率。
特别实施方式7为根据特别实施方式5的方法，其中，所述超声频率引起液体中的空化作用。
特别实施方式8为根据特别实施方式1的方法，其中，所述液体含有悬浮组分，例如像血细胞或者细菌芽孢这样的细胞组分。
特别实施方式9为根据特别实施方式7和8的方法，其中，脉动压力波将引起所述悬浮组分或其部分破裂，例如破坏细胞壁。
特别实施方式10为根据特别实施方式8的方法，其中，所述脉动压力波应用于许多带有间歇停顿的短周期，可以调整周期的长度以便团块悬浮组分(例如，细胞、珠粒或小球)发生解聚集。
特别实施方式11为根据特别实施方式10的方法，其中，所述悬浮组分为纳米粉末。
特别实施方式12为根据特别实施方式1的方法，其中，所述液体包含在微通道或微室中，例如亚毫米尺寸的微通道或微室。
特别实施方式13为根据特别实施方式3的方法，其中，用一维或二维光学扫描装置(例如，检流计)传递所述光能。
特别实施方式14为根据特别实施方式3的方法，其中，吸收部分包括在与液体介质的直接连接中，在该处吸收光能并转化为焦耳热。
应当注意的是，根据本发明，在本发明一个方面上下文中描述的实施方式和特征，还可以应用到本发明的其他方面。
实施例如本实施例中所述，本发明得到实验上的测试和证实。
2mm聚乙烯(PE)基底物质使用准分子激光进行了微机械加工。通道结构的大小加工成100μm宽和25μm深。用红外线吸收染料(PRO-JET830NP，Avecia，英国)制备2mm PE盖，这样所述盖的一个表面将表现出红外线辐射的强吸收，最终在所述表面部分将红外线转化为焦耳热。将该盖焊接到前面提到的具有红外吸收面的通道结构上，形成通道结构的第四壁。
聚焦的激光束(来自高功率商业可供发光二极管(LD)-500mW，808nm)从照像机显微镜安装的相反面定向于基底物质。电子控制LD，这样脉冲和周期长度能够得到调整和控制。
所述通道结构用等渗生理盐水溶液中的抗凝人全血充满；每80％生理盐水20％全血(体积百分比)。
调整聚焦激光束，运行脉冲的宽度为3μs接着47μs期间没有活动，从而产生20kHz重复频率，激光循环的时间图表如图3所示。所述激光循环从控制软件起始，立即观察到液体中的物理骚动。从指示的红细胞的运动清楚地辨别液体的骚动。少于一秒的时间内悬浮的血细胞在激光束周围区域内立即开始裂解。在接下来的3秒时间内，在约150μm通道区域的所有细胞都得到裂解，并且激光脉冲发生的接下来2秒不引起作用向通道其他任何方向进一步蔓延。
在停止激光活动之后观察到以下现象在超声波活动发生的区域周围观察到材料“云”。在围绕活动发生的区域内聚合物进一步永久性的变质或转化得到清楚地鉴定，该区域表现为乳白半透明外观。聚合物表面的永久性变质是高功率超声波活性的普通指示剂。
在高倍放大显微镜下观察通道结构装载的静止液体，显示出亚微粒碎片的小球只存在于通道中受到激光活动的位置。所述碎片由于“布朗运动”波动，从而表明亚微米的尺寸。进一步观察到，在经历了所述处理之后，溶液中没有“空”细胞存在。没有其特有的血红蛋白内容物的空细胞(红细胞)说明，因升高的温度或任何溶液性质的变化(例如pH、生理盐水浓度等)的溶血作用。这清楚地表明，超声裂解引起悬浮细胞溶解。
参考文献Sambrook等人分子克隆实验手册，第三版，卷1和卷2，Sambrook等人，2001，冷泉港实验室出版社(Sambrook et alMolecular cloninga LaboratoryManual3nd edition，Volume 1 and2，Sambrook et al.，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press)WO2004/016948
权利要求
1.一种在液体中产生脉动压力波(PPW)的方法，该方法包括如下步骤a)提供加热装置，b)用该加热装置加热一部分液体，以使所述液体的该部分蒸发，由此形成蒸汽泡，c)冷凝该蒸汽泡，以及d)重复步骤b)和步骤c)。
2.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述PPW为超声波。
3.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述液体包括选自由水、二甲亚砜、丙酮和醇所组成的组中的溶剂，以及和/或非极性溶剂。
4.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述加热装置选自由加热元件和电磁辐射所组成的组。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述电磁辐射在液体中被吸收。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述电磁辐射在与所述液体接触的壁中被吸收。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述步骤b)和c)以固定的频率重复。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述步骤b)和c)以变化的频率重复。
9.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述步骤b)和c)以0.5-1000kHz范围的频率重复，例如10-500kHz、15-150kHz和20-100kHz的范围。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述液体包含于微通道或微室。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述蒸汽泡的尺寸以及其形成和冷凝的速率足以在液体中产生空化作用。
12.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述液体包含微粒。
13.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述微粒选自由生物细胞、微小颗粒和纳米颗粒所组成的组。
14.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述液体包含生物细胞。
15.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述电磁辐射束为激光束。
16.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述光斑的最大尺寸为至多500μm。
17.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述激光束的功效为1mW-200W。
18.根据前述权利要求中任意一项所述的用于裂解液体中生物细胞的方法。
19.根据权利要求18所述的方法，该方法还包括步骤e)分析裂解后的生物细胞的组分。
20.根据前述权利要求中任意一项所述的用于解聚集微粒的方法。
全文摘要
本发明涉及一种脉动蒸汽泡的产生方法，通过该方法受控热源(优选激光3)在封闭液体中产生脉动蒸汽泡4。脉动速率(频率)优选在超声区域内，借此在液体中出现空化作用。所述空化作用的结果是引起悬浮成分例如细胞或细菌芽孢破裂。细胞成分的超声破裂公知为通过超声波裂解。
文档编号G10K15/08GK101095187SQ200580045525
公开日2007年12月26日 申请日期2005年12月23日 优先权日2004年12月31日
发明者托马斯·乌辛 申请人:麦莫斯弗罗有限公司