用于光学仪器的连续、异步自动聚焦的系统和方法

专利名称：用于光学仪器的连续、异步自动聚焦的系统和方法
技术领域：
本发明涉及光学仪器，并且更具体地说，涉及光学仪器内的连续、异步操作的自动聚焦子系统，其保持物镜与成像物体上、成像物体内或成像物体附近的点或表面之间沿着光轴的恒定距离。
背景技术：
数百年来，当光学显微镜和其他基于光学的方法在从科学研究到战争的人类活动的许多领域中得以利用吋，微处理器、现代计算和分子生物的出现促使新的光学仪器和光学成像技术的进一歩加速发展。例如，与并入现代荧光显微镜仪器中的计算设施組合的活細胞内蛋白质的荧光标记允许以显著低于光学显微镜的所说的“衍射极限”的分辨率对活細胞的生物组分的精细细节成像。许多新光学仪器、光学仪器的应用和光学成像技术取决于在延长时间段上和/或扫描与光ζ轴垂直的χ-y平面内的成像物体期间、浅焦深的高倍率光学系统的精确聚焦。示例包括通过在较长时间段上对生物样本中的弱发光荧光团成像来实现衍射极限以下的分辨率的多种光学显微镜技木，和用于扫描活细胞和其他生物样本以通过将χ-y平面中的样本相对于显微镜的光路平移同时保持恒定的ζ位置来对这些样本内的平面成像的光学显微镜技木。光学仪器的聚焦可能随时间推移由于例如热和机电不稳定性而变化，并且随着扫描样本或在一段时间上从样本收集数据时载物台在χ-y平面中平移，即使非常精确的机电显微镜载物台也可能在相对于成像光学元件在距离上有波动。精确的光学仪器的设计人员、制造商和用户不断探索在时间上以及在高度精确光学仪器的多个子组件(包括机电载物台)操作时稳定高度精确光学仪器的聚焦的系统和方法。

发明内容
本发明的实施例旨在提出光学仪器内的自动聚焦子系统，该自动聚焦子系统连续地监视光学仪器的聚焦并调整沿着光轴的光学仪器内的距离，以便将精确且稳定的光学仪器聚焦保持在样本上、样本内、或样本附近的特定点或表面处。本发明的某些实施例相对于嵌入它们的光学仪器的其他组件和子系统的操作异步地操作。


图IA-图IC图示荧光显微镜内的光路。图2A-图2B示出随着时间推移(在图2A的情况中)或样本的χ和/或y平移 (在图2B的情况中)期间，物镜焦点的位置在样本内相对于光轴或ζ位置的非期望变化。
图3图示显微镜的传统自动聚焦子系统。图4和图5提供图示传统自动聚焦模块的操作的控制流程图。图6提供图示本发明的某些实施例的ー个方面的控制流程图。图7A-图7C图示独立于上文參考图IA-图IC和图3论述的荧光显微镜的机电载物台的ζ轴扫描。图8图示小光圈焦点检测器的操作的原理。图9A-图9C图示表示本发明的一个实施例的针孔光圈转子。图IOA-图IOB图示在本发明的备选实施例中使用的不同类型的转子。图11示出本发明的附加实施例中使用的第三种类型的转子。图12图示并入在表示本发明的一个实施例的荧光显微镜的光路内的、同样表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块。图13A-图131图示用于由表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块的自动聚焦处理子组件计算物镜与显微镜的盖玻片(cover slip)介面之间的当前距离的ー种方法。图14图示根据本发明的一个实施例的、根据密度值累计和计算光学仪器的当前ζ位置。图15图示典型环形光圏。
具体实施例方式图IA-图IC图示荧光显微镜内的光路。光路和包含光路的荧光显微镜用作描述本发明的一个实施例的上下文。但是，正如下文也提到的，在许多情况中，可以通过调整本发明的实施例的多种參数和配置以在特定应用中使用来将本发明的方法和系统并入范围广泛的不同类型的光学仪器中。荧光显微镜的光路包括激发光源102 ( 一般为可见光或UV光激光器)、将激发光 106反射到物镜或透镜108的多向色镜104，物镜或透镜108将激发光聚焦在放置在机械载物平台114上的盖玻片112的远侧上支承的样本内的点110，机械载物平台114具有激发光通过的光圈116。激发光刺激样本内的荧光团的荧光发射。从一般具有的波长比激发光的波长更长的荧光团发射的光经由物镜或透镜108以及经由多向色镜104传递回ー个或多个镜筒透镜118，ー个或多个镜筒透镜118将荧光团发射的光聚焦在光检测器120上，光检测器120常常是电荷耦合装置(“CCD”)检测器。光检测器测量的空间强度由计算子系统进行电子处理以生成被成像物体的图像，这些图像被存储在电子存储器和海量存储装置中以及进行渲染以便在电子显示装置上显示。多向色镜104反射较短波长的光(包括激发光)，并且还可以反射非常长波长的光(如红外光)，但是对于包括荧光团标记的样本内的荧光团发射的光波长的波长范围内的可见光是透明的。相似地，激发光106的初始路径上的ニ向色镜122对于较短波长激发光透明，但是反射较长波长的红外光，正如下文更详细地论述的。包括载物平台114、载物台驱动组件1 和χ 126,y 1 和ζ 130平移机构的机电载物台用于相对干物镜和仪器光路在x、y和ζ方向中移动样本。注意，光轴或ζ轴与垂直延伸的光路平行，在图IA中，光路从样本点110经由物镜、多向色镜和镜筒透镜垂直地延伸到检测器120上的对应图像点132。在图IB中，χ平移机构126已被激活以将载物平台114向右移动小距离+ Δχ 140，这导致焦点在样本内等量但在X方向中反向移位-Δχ 142。換言之，在载物平台在χ方向中平移距离+Δχ之后，先前焦点110和新焦点144分隔量值I ΔΧ|142的距离。图IC以与图IB相似的方式示出激活ζ平移设备130以将机械载物台114在ζ或光轴方向中移动小距离-Δζ 146，从而导致焦点在样本内平移等量148但反向的距离+Δζ。在本文论述中， 假定如图IA所示，至少在从样本进行图像采集期间的一段时间上，检测器120与镜筒透镜 118之间的距离是固定的，因此固定物镜的焦点。在包括活细胞成像的许多荧光显微镜应用中，高分辨率图像的采集取决于在如下时间段相对于物镜对固定位置中的特定样本成像该时间段足以从弱发光荧光团收集足够的信息以重构样本内的荧光团标记的图像。在其他应用中，通过在χ-y平面中相对于物镜移动机电载物台、同时保持恒定的聚焦或物镜与样本之间在ζ或光轴方向中恒定的距离， 来扫描样本。在两种情况中，均需要在一段时间上和/或当在χ和y方向中平移机械载物台时，将物镜与样本内的点或表面之间的距离保持在精确固定的值。图2A-图2B示出随着时间推移(在图2A的情况中)或样本的χ和/或y平移 (在图2B的情况中)期间，物镜焦点的位置在样本内相对于光轴或ζ位置的非期望变化。 在这两个附图中，物镜与样本之间的期望距离由虚线202和204指示。物镜与样本之间的实际距离在两个附图中示出为实曲线206和208。尽管尽力保持物镜与样本内的点或表面之间的固定距离，但是物镜与样本之间在ζ或光轴方向中的实际距离随着时间推移以及在 χ和/或y平移期间而改变。这些变化有许多不同的原因。例如，显微镜环境中的热不稳定性可能导致光学仪器在含ζ轴分量的方向上的膨胀或收縮。光学仪器常常被温度控制腔体包围，但是光学仪器的组件可能产生并散发热，包括光源、电动机和其他此类组件，这无法立即进行补偿。空气压カ和其他环境參数中的波动也可能导致物镜与样本之间的距离上的变化。当机电载物台的x_y平面朝向即使稍微与光轴不垂直吋，在通过x_y平面中平移来进行扫描期间，样本也会在ζ方向中相对于物镜移动。图3图示显微镜的传统自动聚焦子系统。已开发自动聚焦子系统来随时间推移将焦点位置相对于光轴稳定在样本内，并同时在x_y平面中移动样本。图3使用与图IA-图 IC中使用的相同图示约定。图3所示的自动聚焦子系统使用与激发光源102不同的自动聚焦光源302。在许多系统中，自动聚焦光源发射红外光304，其一部分被分光镜308向下反射到ニ向色镜122，其将红外光在图3中的水平方向106中反射，其沿着与激发源102发射的光所采取的相同光路，从该相同光路处、由多向色镜104将该红外光经由物镜108反射到样本110。红外光在盖玻片310的远侧与样本介质之间介面处被散射，反向散射的红外光的一部分经由物镜108和光路元件104、122和308返回。反向散射的红外光的一部分经由分光镜308传递到自动聚焦模块320。此外，在多种备选配置中，可以将自动聚焦光源 302和自动聚焦检测器模块320的位置绕着分光镜308翻转，且结果是等效，并且可以更改发光源和自动聚焦光源的相对位置，以及其他光路组件的特性的改变。应该注意，短语“盖玻片”意在包括显微镜中常常采用的传统盖玻片以及大范围的不同类型的样本腔和样本保持装置的任何ー种的表面。相对于样本具有固定位置的多种介面的任何一种均能用作反向散射的自动聚焦光的光源，以便检测和校正样本平面相对于ー个或多个物镜的ζ位置上的错位。自动聚焦模块320周期性地控制载物台驱动124以在ζ轴位置的范围322上沿着
7光轴平移载物台，并记录每个ζ轴位置的光強度，从而至少在概念上生成强度对ζ位置的绘图324。ζ范围内对应于物镜的焦点与盖玻片的远侧重合的ζ位置由強度曲线峰值3 下面的ζ位置3 指示，因为反向散射光的最高強度出现在盖玻片的远侧与物镜焦点重合吋。 有多种不同类型的自动聚焦模块执行周期性ζ-轴扫描以便确定盖玻片与样本介质的介面与光学仪器的焦点重合时载物平台的当前ζ-轴位置。然后，该自动聚焦模块能够将机电载物台驱动到相对于所确定的焦点的ζ-轴位置的期望ζ-轴位置，以便将焦点重新定位在样本内期望的ζ-轴位置。图4和图5提供图示传统自动聚焦模块的操作的控制流程图。图4提供传统自动聚焦操作的高层面控制流程图。自动聚焦操作是包括步骤402和404的连续循环。在步骤 402中，自动聚焦操作等待直到下一次自动聚焦事件发生，例如自动聚焦定时器期满或来自光学仪器操作员的调用下一次自动聚焦操作的手动输入。然后，在步骤404中，调用例行程序“自动聚焦”来执行ζ位置范围上的扫描，正如上文參考图3论述的，以便确定物镜的焦点与盖玻片与样本介质的远介面重合时的当前ζ位置。虽然自动聚焦操作在图4中示出为连续的循环，但是应该注意，由调用例行程序“自动聚焦”表示的实际自动聚焦操作是按离散的时间间隔发生的，并且自动聚焦操作是破坏性的，一般会中断包括成像或机电载物台的平移的其他操作。图5提供图4的步骤404中调用的例行程序“自动聚焦”的控制流程图。在步骤 502-505的for-循环中，自动聚焦模块控制载物台驱动以全程扫描ζ位置范围。对于该范围内的每个ζ位置，在步骤503中，自动聚焦模块将机械载物台驱动到ζ位置，并在步骤504 中，測量反向散射的自动聚焦光的強度。一旦在步骤502-505的for-循环中对ζ位置范围内的每个位置測量了反向散射的自动聚焦光強度，在步骤506中，例行程序“自动聚焦，，计算与反向散射的光的最大強度对应的ζ位置，并且然后在步骤508中，将机械载物台驱动到相对步骤506计算的ζ位置计算的ζ位置。例如，可能期望，焦点应保持在样本内10微米的恒定ζ位置处，并且由此在步骤508中，自动聚焦计算等于10微米加上光学仪器聚焦在盖玻片的远侧上时当前ζ位置的ζ位置，并将机电载物台驱动到该位置。传统或常规自动聚焦子系统(如上文參考图3-5所论述的那些)与许多问题和缺点关联。ー个重大问题是，如上文提到的，自动聚焦子系统的操作中断光学仪器正在执行的任何其他操作。例如，当光学仪器正在固定的ζ位置处进行样本的χ-y平面扫描吋，毎次自动聚焦操作都中断该扫描以便监视扫描期间ζ位置的稳定性。自动聚焦采用的ζ-轴扫描会使获取图像所需的时间增加很多时间。与传统自动聚焦子系统关联的第二个缺点是，由于自动聚焦操作是按离散的时间间隔执行的，所以仪器的ζ轴位置可能在自动聚焦间隔之间漂移。减小自动聚焦操作之间的间隔以便将Z-轴漂移减到最小，这进ー步导致数据收集时间的増加。与自动聚焦操作关联的再ー个问题是，由于自动聚焦本身是随着时间推移通过遍及Z位置范围地移动机电载物台来执行的，因此在自动聚焦操作期间，仪器和环境不稳定性可能改变，从而大大地降低能够确定仪器焦点位置以及校正Z-轴漂移的精确度。本发明的实施例旨在提出一种连续操作且快速的自动聚焦模块，其相对于其他光学仪器组件和子系统的操作(包括机电载物台的平移和图像采集操作)异步地操作。图6 提供图示本发明的某些实施例的ー个方面的控制流程图。本发明的实施例能够实现的连续异步自动聚焦操作由步骤602-604的连续执行循环来表示。在步骤602中，在一个实施例中，通过计算从盖玻片与样本介质之间的介面反向散射的光在自动聚焦模块光检测器上产生最高强度时的ζ-轴位置来连续地监视此介面的ζ-轴位置。当介面相对于物镜的ζ轴的位置改变吋，或相对于物镜的另ー个ζ-轴位置改变吋，在步骤604中，以小校正距离ΔΖ驱动机电载物台，从而保持物镜与样本内的特定点或表面的恒定距离。因为表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块连续地操作，而不会中断光学仪器的其他组件的操作，所以数据收集时间不受影响，并且能够比传统自动聚焦模块更稳定地且长时间更高精度地保持光学仪器的聚焦。由于表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块连续且快速地再计算盖玻片与样本介质的远介面的ζ-轴位置，所以能够以比传统自动聚焦模块更高精确度连续地确定物镜相对盖玻片介面的ζ-轴位置，因为每次自动聚焦所需的时间量远远小于传统自动聚焦模块中的情况，并且因此在本发明的所述实施例中，自动聚焦操作期间可能发生的最大漂移量比传统自动聚焦模块中少。图7Α-图7C图示独立于上文參考图IA-图IC和图3论述的荧光显微镜的机电载物台的ζ轴扫描。图7Α-图7C图示假想系统，与图IA-图IC和图3所示的相似，其中能够当在ζ方向中相对于物镜移动样本的同吋，相对于镜筒透镜移动自动聚焦模块内的检测器。在图7Α中，盖玻片的内介面上的点距离物镜或透镜706保持在特定ζ-轴位置~704处。 将从盖玻片的内表面反向散射的光聚焦在保持在相对于聚焦透镜714的固定ζ-轴位置Zd 712处的检测器710上。在图7Β中，已将机械载物台移动得更靠近物镜，并且盖玻片702的内介面至物镜706之间的距离现在720，而非图7Α所示的初始距离~ 704。自动聚焦模块中的检测器710已从聚焦透镜714移开对应的距离，以使从内盖玻片介面702反向散射的光保持聚焦706在检测器上。相似地，如图7C所示，当较图7Α中的情况将载物台远离物镜地移开时，内盖玻片介面与物镜之间的距离为724，需要移动检测器710向聚焦透镜714更靠近，其结果是检测器和聚焦透镜间隔更短距离く 726，以使从内盖玻片介面反向散射的光保持聚焦在检测器706上。ζ-轴扫描不仅能够通过在ζ方向中相对于物镜来移动载物平台来执行，而且也能
够通过沿着自动聚焦子系统的光轴相对于自动聚焦模块聚焦透镜移动自动聚焦模块检测
器来执行。当相对于自动聚焦模块内的聚焦透镜在ζ位置的整个范围上移动检测器时，该
范围内的ー个Z位置将对应于自动聚焦模块内的聚焦透镜的焦点，进而对应于光学仪器的
光轴中物镜与盖玻片的介面之间在Z方向中的当前距离。自动聚焦模块设法检测并校正的
物镜与盖玻片介面之间的距离的改变，在从盖玻片介面反向散射的光聚焦在自动聚焦模块
检测器上时聚焦透镜的焦距的改变中反映出来。因此，检测器能够在Z-轴方向中、在自动
聚焦模块内相对于聚焦透镜在物理上或逻辑上移动且能够确定何时从盖玻片介面反向散
射的光聚焦在检测器上，该检测器能够用于确定检测器相对于聚焦透镜的位置^!，在自动
聚焦模块内，这对应于物镜与盖玻片的介面之间的当前距离^。这样允许通过如下关系确
定物镜与盖玻片介面之间的距离\的绝对值 1zC= ~α —
zd比例常数α可以由自动聚焦模块和光学仪器共用的光路的几何形状以及自动聚焦模块聚焦透镜和光学仪器的一个或多个物镜的特性来确定。图8图示小光圈焦点检测器的操作原理。在图8中，示出不透明材料内的小圆形光圈802、804和806，其相对于三个不同聚焦的光束。第一个光束聚焦在圆形光圈812下方的点810处，因此该光束的一部分落在不透明材料的背侧，而仅该光束的具有圆形横截面814 的中央锥形部分通过圆形光圏。如果光束未部分地被不透明材料阻挡，则光束在离焦点与圆形横截面814相同的距离处的圆形横截面816将会有更大的直径和面积。因此，通过光圈后的光強度的降低与圆形横截面814面积与圆形横截面816面积之比成比例。当光束聚焦在与光圈重合的点处时，如图8的示例804中所示，所有入射光通过光圈，并且通过光圈的光的強度等于该光束通过光圈之前的強度。当输入光的焦点落在光圈之外吋，如图8的第三示例806中所示，输入光中焦点之前的一部分落在不透明材料的背侧上；因此如情况 802 —祥，仅聚焦的光束的一部分820通过光圏。因此，位于小圆形光圈后的光检测器測量通过小圆形光圈的光束的強度，可以使用该光检测器来指示输入的聚焦光束的焦点何时落在光圏内。例如，光检测器检测到的強度对聚焦透镜相对于圆形光圈的ζ位置的绘图展示 ζ = 0826,当绘图的水平轴拟4上的点对应于测量的強度拟8的峰值时，聚焦透镜将光聚焦为在光圈内针孔光圈相对于聚焦透镜的ζ-轴位置。正如參考图7A-图7C论述的，用于相对于聚焦透镜移动检测器的机械驱动可用于确定与从盖玻片介面反向散射的光的焦点所对应的针孔光圈与聚焦透镜之间的距离其中检测器包括位于针孔光圈后适当距离处的光检测器，如图8所示。但是，可机械方式移动的检测器是昂贵的，并且存在与光学仪器在ζ方向中扫描关联的相同时间延迟。不使用能够在ζ方向扫描中的焦点检测器，如图7A-图7C所示，本发明的实施例采用固定的光检测器和快速平移针孔光圈或快速且增量地延长的聚焦光束来执行表示本发明的实施例的自动聚焦模块内的ζ-轴扫描。图9A-图9C图示表示本发明的一个实施例的针孔光圈转子。针孔光圈转子902介入自动聚焦模块904的聚焦透镜904与自动聚焦模块内的光检测器906之间，光检测器906 測量落在光检测器上的光的強度。针孔光圈转子902包括多个垂直圆柱形轴体(shaft)， 当垂直圆柱形轴体旋转到聚焦透镜与光检测器之间且与之对齐的位置吋，光经由该圆柱形轴体从聚焦透镜904传递到光检测器906，如图9A中的垂直圆柱形轴体918所示。每个垂直圆柱形轴体包含具有中央针孔的不透明碟，如垂直圆柱形轴体914内具有中央针孔光圈 922的不透明碟920。这些不透明碟设在离每个不同垂直圆柱形轴体中的针孔光圈转子的上面不同距离处。如图9A所示，转子的上面与针孔光圈之间的距离随着垂直圆柱形轴体的数值标记的增加而线性增加，从而在针孔光圈转子902的垂直圆柱形轴体内形成针孔光圈的ζ-轴位置范围。针孔光圈转子902包括至少ー个物理索引926，至少ー个物理索引拟6 能够被自动聚焦模块内的索引检测器读取以确定特定的垂直圆柱形轴体何时被定位于将来自聚焦透镜904的光透射到光检测器906。可以将物理索引拟6的位置检测和针孔光圈转子的旋转速度的已知信息一起使用来计算随着电动机将针孔光圈转子以恒定的速度旋转时每个垂直圆柱形轴体被对齐以将光从聚焦透镜传递到光传感器的时间。该物理索引可以是磁盘、发光二极管、反射板或其他类型的物理索引，其位置能够随着物理索引旋转通过特定位置时被索引检测器(例如，电磁线圈、光检测器或激光器/光检测器)快速地确定。图9B示出在与ζ轴平行的方向中观察时的针孔光圈转子。当第一垂直圆柱形轴体940与聚焦透镜和光检测器在參考位置R942对齐吋，其余的垂直圆柱形轴体Ii1-Iv1按相对于对齐的垂直圆柱形轴体940递增的旋转角度Θ^Θμ被定位。在图9C中提供的绘图中，其中相对于水平轴960在0至360度的范围上绘制针孔光圈转子的旋转角度，实心圆 (如实心圆962)表示相对于左边垂直ζ位置轴964绘制的，每个针孔光圈相对于光检测器的ζ位置，而空心圆(如空心圆966)表示相对于右边垂直强度轴968绘制的光检测器检测到的強度。随着针孔光圈转子从0度(图9C中的970)旋转到360度(图9C中的972)，当前对齐的垂直圆柱形轴体内的针孔光圈与光检测器之间的距离增加，而光检测器处测量的強度在与特定针孔光圈至光检测器Zd距离977对应的特定旋转角度976处达到峰值974。 因此，旋转的针孔光圈转子902与固定位置的光检测器906的組合能够用于快速且反复地扫描表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块内的ζ-轴位置，以确定测量的强度为最大时针孔光圈与聚焦透镜之间的距离^。正如上文论述的，该距离与光学仪器中盖玻片介面与物镜之间的距离相关联。图IOA-图IOB图示表示本发明的备选实施例中使用的不同类型的转子。如图IOA 所示，不将针孔置于针孔光圈转子的垂直圆柱形轴体内的不同距离处(如图9A所示)，在本发明的备选实施例中，路径延长转子1002在路径延长转子的圆柱形垂直轴体内包括多种高度或厚度的玻璃或其他透明材料的实心圆柱形杆体。作为备选，不具有变化的高度，而是这些实心圆柱形杆体可以具有相等高度，但是可以由具有不同折射率的不同材料构成。本质上，这些可以想到提供变化的聚焦延长(focus-extension)度或聚焦延长长度的碟形窗 ロ。在图IOA中，聚焦延长窗ロ由阴影指示，如路径延长转子1002的圆柱形垂直轴1006内的窗ロ 1004。旋转路径延长转子以使连续的垂直圆柱形轴体与聚焦透镜1010与位于光检测器1014上方的针孔光圈1012之间的光路对齐。如图IOB所示，具有的折射率n2大于空气折射率Ii1的材料的透明圆柱形杆体以使得聚焦的光束的焦点1022与没有透明圆柱形杆体的情况下光束所具有的焦点IOM的距离延长与该圆柱形杆体的高度10 成比例的距离 1026的方式折射聚焦的输入光束1020。因此，通过将增加厚度或増加折射率的窗ロ包括在路径延长转子1002中，以及通过旋转该转子以连续地扫描包含这些窗ロ的垂直圆柱形轴体，该路径延长转子能够用于(正如图9A的针孔光圈转子902)实现表示本发明的ー个实施例的自动聚焦模型内的ζ-轴扫描。路径延长转子的旋转产生与图9A中的针孔光圈转子 902的绘图9C相似的相对于旋转角度的ζ-轴/強度绘图。图11示出本发明的附加实施例中使用的第三种类型的转子。此转子与图9A所示的针孔光圈转子相似，所不同的是，不使用一系列垂直圆柱形轴体，而是采用转子1104内的几乎圆形的槽1102，其中以螺旋槽型光圈1106和环绕不透明螺旋形构形的材料形成连续的槽型光圏，该连续的槽型光圈在ζ-轴位置上从最大ζ位置1108到最小ζ位置1110连续地递减。在附加实施例中，采用辐条形构件来将槽型光圈转子的内部部分保持到槽型光圈转子的外部部分。上文參考图9A-图11论述的多种自动聚焦转子具有如下特征，在路径延长转子的情况中，随着旋转或移位角度，均勻地减少或增加光圈的ζ位置或均勻地增加或减少窗ロ 厚度，且具有单个不连续，如图9A中的垂直轴体917和918之间的针孔光圈的ζ位置之间的不连续性。但是，具体在使用物理索引标识每个垂直圆柱形轴体吋，ζ位置或窗ロ厚度可以任意改变，其中旋转角度和测量的強度通过映射表或函数映射到ζ位置。即使在仅使用 ー个或几个物理索引的情况中，也能够由自动聚焦子系统管理来通过计算方式管理窗ロ厚度或ζ位置的任意布置，只要转子的每个移位角度处的垂直轴体内的光圈的窗ロ厚度或ζ位置是已知的且可在存储器或海量存储装置中获取即可。在本发明的某些实施例中，多个垂直轴可以包含完全相同的窗ロ或光圈的ζ位置，并且在某些情况中，ζ位置或窗ロ厚度可以呈正弦变化，以使窗ロ厚度或ζ位置随着转子旋转没有不连续性。图12图示并入在表示本发明的一个实施例的荧光显微镜的光路内的、同样表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块。图12使用与图IA-图1C、图3和图9-11中使用的相同图示约定。该自动聚焦模块包括聚焦透镜1202、安装于通过电动机1206自转的轴向轴体的自动聚焦转子1204、转子索引检测器1208、光检测器1210和基于以连续的方式从聚焦透镜1202经转子1204传递到光检测器1210上的光的测量强度计算z_轴位置的自动聚焦处理组件1212。在本发明的某些实施例中，可以使该转子按超过每分钟1000次回转的速度自转，允许物镜与盖玻片介面之间的距离按每秒十次或更大的速率计算。转子1204可以是针孔光圈转子(正如上文參考图9A-C论述的)、路径延长转子(正如上文參考图10A-B 论述的)、槽型光圈转子(正如上文參考图11论述的)，或単独或与相对于聚焦透镜1202 与光检测器1210之间的光路中的光检测器处在固定距离处的针孔光圈组合来实现自动聚焦光源302产生并从盖玻片介面310散射的自动聚焦光的ζ-轴扫描的任何其他类型的转子。自动聚焦处理组件1210连续地计算Δ ζ校正并向载物台驱动IM发出ΔΖ平移指令以连续地再定位机械载物台，从而使物镜108与盖玻片介面310之间的距离保持恒定。正如上文论述的，虽然表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块采用从盖玻片介面反向散射的光，或从相对于样本具有固定位置的另ー个介面反向散射的光来计算物镜(objective) 与盖玻片介面之间在ζ方向中的距离，但是表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块能够用于相对于光学仪器的镜筒透镜和检测器将物镜的焦点稳定地保持在样本内任意选定的位置处。再者，短语“盖玻片介面”和“盖玻片”意在广义地涵盖能够被自动聚焦系统采用作为反向散射自聚焦的光的源的多种类型的介面中的任何ー种。应该注意可以采用多种方式将表示本发明的实施例的自动聚焦模块并入光学仪器中。在许多情况中，可以手动或自动激活该自动聚焦模块来对于指定或计算的时间期间执行自动聚焦。在其他一些情况中， 该自动聚焦子系统可以在某些类型的图像采集模式期间通过编程来激活。在所有情况中， 在光学仪器的正常ζ平移期间或其它时间，可以手动或自动脱离该自动聚焦模块。图13A-图131图示用于由表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块的自动聚焦处理子组件计算显微镜的盖玻片介面与物镜之间的当前距离的ー种方法。该方法采用移位寄存器阵列1302、附加的寄存器阵列1304、加法运算器阵列1306、三个附加寄存器 1308-1310、光检测器输入1312和转子索引检测器输入1314。在表示本发明的一个实施例的计算子系统的所述实施例中，这些寄存器和移位寄存器的寄存器组件具有以位为単位的适合大小，以便包含等于三倍于光检测器报告的最大取值的强度值的数值。一般，16-位或 32-位寄存器对于精确的ζ-位置计算是大小足够的。电路和/或固件或软件形式实施且图13A-I中图示的ζ-位置计算逻辑，以等于表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块内的转子的旋转频率的频率来计算盖玻片介面相对于物镜的相对ζ位置。光检测器输入1312是表示光检测器在特定时间点处检测到的光的強度的数值。索引检测器输入1314选择时间点与特定移位寄存器之间的映射，以及选择时间点来执行并行移位运算、并行加法运算和以表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块内的转子旋转的频率一起计算ζ位置的其他运算。
计算是高度并行的且包括异步方面。正如图UB-D所示，随着表示本发明的ー个实施例的自动聚焦模块内的转子旋转，以及随着索引检测器确定转子的特定圆柱形孔与自动聚焦模块的光路对齐的时间点，将光检测器强度值输入到每个四寄存器移位寄存器的第一个寄存器。在图13B中，对应于第一转子轴体的强度值ら置于包括寄存器1320-1323的第一个移位寄存器的第一个寄存器1320中。在图13D中，转子进行了一次完整的回转，使得强度值被置于移位寄存器阵列的所有第一个寄存器中。然后，在一个自转完成时，并行移位寄存器将所有值向右移位ー个位置，如图13E所示。因此，通过并行移位运算，移位寄存器的阵列中值的列13M移位到图13E中的列13沈。最后一列寄存器13 的值被丢弃。如图13F所示，在图13E所示的并行移位运算之后，与利用下ー个序列的強度值填充移位寄存器阵列的第一列13M寄存器的同吋，激活并行加法运算器1306以计算每个四寄存器移位寄存器中的后三个寄存器之和，并将和置于寄存器1304的列中。加法过程是并行且相对于将新光检测器值转移到移位寄存器阵列的第一列13M寄存器中异步地执行的。当完成加法时，调用微处理器实现的例行程序以便计算ζ-轴位置范围内与寄存器1304的列内的最大检测到的強度对应的ζ-轴位置。注意，此过程是在转子的最近三次扫描上取均值。计算的ζ-轴位置被置于寄存器1308中，以呈示物镜与盖玻片介面之间在ζ方向中的当前距离， 如图13G所示。然后，如图13H所示，从存储在寄存器1309中的期望的ζ位置减去当前ζ 位置，以产生存储在寄存器1310中的ΔΖ校正，然后将其输出到载物台驱动。注意，ΔΖ校正的计算与利用从光检测器输入获得的下一組强度值填充并行移位寄存器的寄存器的第一列13Μ并行地进行。当如图131所示获得下一组强度值时，激活并行移位寄存器以将强度值的列移位ー个位置，以便准备下ー个Δ ζ校正的计算。图14图示根据本发明的一个实施例的根据密度值累计和计算光学仪器的当前ζ 位置。图14图示置于參考图13G论述的本发明的实施例中的寄存器1308中的当前ζ位置的计算。在图14中，由实心圆(如实心圆1402)来表示每个圆柱形轴体位置处的强度值。 強度值是相对于垂直轴1404来绘制的，圆柱形轴体位置是相对于水平轴1406来绘制的。 绘制的实心碟对应于參考图13G论述的并行加法之后寄存器1304的列的内容。虽然强度峰值总是落在与特定圆柱形轴体对应的转子位置处会方便些，以及测量的強度无误差会方便些，但是情况常常不是这样。因此，表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块的自动聚焦处理组件可以采用许多不同的曲线拟合算法之ー来将理想化的強度曲线1408拟合到绘制的点。然后可以将估计的ζ位置计算为与计算的曲线1408的峰值强度1412对应的ζ位置 1410。如图14所示，计算的ζ位置可以落在与表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块测量光強度所在的旋转角度对应的ζ位置之间。因此，转子中轴体的数量可能小于、等于或大于能够在由自动聚焦模块扫描的ζ位置范围内驱动机电载物台的位置的数量。虽然通过分析反射回的自动聚焦光的強度来确定从物镜到盖玻片介面的距离，正如上文參考图3的曲线图3Μ论述的，这提供了由自动聚焦处理组件(图12中的1212)分析通过自动聚焦光检测器收集的数据的ー个基础，但是其他方法也是可能的。在表示本发明的备选实施例的一个备选方法中，不确定反向散射的光的強度最高处的ζ位置，而是该自动聚焦系统在光学系统的用户或光学系统的自动化程序控制选择的ζ位置处开始校准操作，其中在选定的ζ位置稍稍上方和稍稍下方执行ζ位置扫描。扫描的目的是在从盖玻片介面反向散射的光的类高斯(Gaussian-like)強度曲线中识别与类高斯曲线的陡峭边对应的那些ζ位置以及对应的自动聚焦转子位置。在高斯曲线的此部分中，反向散射的自动聚焦光強度中测得的变化最灵敏地与物镜相对于盖玻片介面的ζ位置中的变化相关。然后，在校准之后的数据收集阶段期间，连续地监视从识别的自动聚焦转子位置测量的強度中的变化，并控制ζ位置以保持那些识别的自动聚焦转子位置处校准步骤的強度。因此，在分析自动聚焦光检测器获得的数据的此备选方法中，将光学仪器的ζ位置控制为不是对反向散射的自动聚焦光处于最大强度时的ζ位置的相对偏移，而代之将其控制为保持对于ζ 位置变化最灵敏的那些自动聚焦转子位置处测量的反向散射的光的校准步骤确定的强度。 在本发明的再一些附加实施例中，可以使用更复杂的曲线拟合算法来精确地将测量的反向散射的自动聚焦光强度拟合到经验确定的或理论上的反向散射的自动聚焦光对ζ位置曲线，以便将光学仪器ζ位置保持在期望的值。在本发明的另ー个实施例中，将附加的光学组件引入到自动聚焦系统中红外光自动聚焦源302与分光镜308之间，或调谐或修改光路内现有的光学组件，以便产生稍微会聚或稍微发散的自动聚焦光束，而非平行光线的光束。通过将稍微会聚或发散的光束输入到光学系统中，自动聚焦光不会最终聚焦在样本内的一点。当将自动聚焦光精确地聚焦在样本内吋，自动聚焦光的高強度可能有害地影响样本和光学数据收集。例如，当使用红外自动聚焦光吋，高度聚焦的自动聚焦光可能导致样本内的高温，并损坏活细胞或导致样本的化学成分中温度引起的变化。在本发明的另ー个实施例中，将环形光圈置于红外自动聚焦源302与分光镜308 之间，以使仅被物镜按陡峭角度向盖玻片介面聚焦的那些光线经由环形光圈透射。反射回的光的比例对于此类陡峭角度的光线最大，并因此通过采用环形光圈过滤掉对反射回的强度贡献很少的不太陡峭角度的光线来减少样本上的入射光的总量同时仍保持必要的反射回的自动聚焦光强度是可能的。图15图示典型环形光圏。环形光圈1502在不透明或半透明碟1506内包括透明或空环1505。可以在本发明的多种实施例中采用多种不同类型的环形光圈的任何ー种。虽然本发明是依据特定实施例来描述的，但是本发明不应局限于这些实施例。多种修改对于本领域技术人员将是显见的。例如，正如上文论述的，可以使用多种不同类型的机械转子的任何ー种来在光轴方向中实现ζ位置扫描，以便找到从盖玻片介面反向散射的自动聚焦光的峰值强度，从而确定物镜相对于盖玻片的当前ζ位置。多种不同类型的自动聚焦处理子组件可以由逻辑电路或软件控制的微处理器来实现，以便通过改变多种设计和实现參数的任何ー种来根据从自动聚焦系统的光检测器收集的强度数据连续地计算Z位置，这些设计和实现參数包括编程语言、模块化组织、控制结构、数据结构和其他參数出于解释的目的，前文描述使用了具体术语以便提供对本发明的透彻理解。但是， 对于本领域技术人员来说，显然并非必需这些特定细节才能实践本发明。前文对本发明的具体实施例的描述是出于说明和描述的目的而给出的。它们不应是穷举的或将本发明限于所公开的精确形式。根据上述教导，许多修改和变化是可能的。示出和描述这些实施例以便最佳地解释本发明的原理及其实际应用，以便使本领域技术人员能够通过适于所设想的具体用途的多种修改来最佳地利用本发明及多种实施例。本发明的范围应由所附权利要求及其等效物来限定。
权利要求
1.一种自动聚焦子系统，包括 自动聚焦光源；光学组件，其将光从所述自动聚焦光源引导到光学仪器的光路中； 聚焦透镜，其将从所述光学仪器的所述光路返回到所述自动聚焦系统的自动聚焦光聚焦到光检测器上；以及介于所述聚焦透镜与光检测器之间的自动聚焦转子，其实现光轴扫描以确定对于从所述光学仪器的所述光路中的表面反射回的自动聚焦光的、所述聚焦透镜的焦点。
2.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦转子包括 绕着中心轴线旋转的圆柱形转子；多个中空成圆形布设的圆柱形轴体，其在所述中心轴线的方向中跨过所述转子；以及不透明碟，其具有中央针孔，且安装在每个圆柱形轴体内与所述转子的顶部相距特定距离处，所述特定距离对应于从所述聚焦透镜起的自动聚焦子系统光轴位置&。
3.如权利要求2所述的自动聚焦子系统，其中，随着所述自动聚焦转子旋转，每个圆柱形轴体移动，进而移入和移出所述聚焦透镜与所述光检测器之间的所述自动聚焦子系统光路，以便在所述中央针孔与所述自动聚焦子系统光轴对齐吋，通过所述中央针孔的自动聚焦光落在所述光检测器上。
4.如权利要求3所述的自动聚焦子系统，其中，当每个圆柱形轴体内的每个针孔与所述自动聚焦子系统光轴对齐吋，由所述自动聚焦子系统记录光強度。
5.如权利要求4所述的自动聚焦子系统，其中，由所述自动聚焦子系统将每个记录的光強度映射到所述圆柱形轴体内所述针孔的所述^!，其中当所述针孔与所述自动聚焦子系统光轴对齐时，所述自动聚焦光通过所述针孔以落在所述光检测器上并生成所记录的强/又。
6.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦转子包括 绕着中心轴线旋转的圆柱形转子；多个中空成圆形布设的圆柱形轴体，其在所述中心轴线的方向中跨过所述转子；以及安装在每个圆柱形轴体内的圆柱形透明杆体或聚焦延长窗ロ，每个圆柱形透明杆体或聚焦延长窗ロ具有特定的厚度和/或特定的折射率。
7.如权利要求6所述的自动聚焦子系统，其中，将单个固定的针孔光圈安装在所述转子与所述光检测器之间。
8.如权利要求7所述的自动聚焦子系统，其中，随着所述自动聚焦转子旋转，每个圆柱形轴体移动，进而移入和移出所述聚焦透镜与所述光检测器之间的所述自动聚焦子系统光路，以使通过当前位于所述光路内的圆柱形轴体的所述自动聚焦光聚焦在相对于所述针孔光圈的ζ位置，所述ζ位置由所述圆柱形轴体内安装的所述聚焦透镜的光学特性和所述聚焦延长窗ロ的聚焦延长特性来确定。
9.如权利要求8所述的自动聚焦子系统，其中，当每个圆柱形轴体内的每个窗ロ与所述自动聚焦子系统光轴对齐吋，由所述自动聚焦子系统记录光強度。
10.如权利要求9所述的自动聚焦子系统，其中，由所述自动聚焦子系统将每个记录的光強度映射到所述圆柱形轴体内的所述聚焦延长窗ロ的聚焦延长特性，其中当所述聚焦延长窗ロ与所述自动聚焦子系统光轴对齐时，所述自动聚焦光通过所述聚焦延长窗ロ以落在所述光检测器上并生成所记录的強度。
11.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦转子包括绕着中心轴线旋转的圆柱形转子；ー个或多个中空螺旋形轴体，其在所述中心轴线的方向中跨过所述转子；以及所述ー个或多个螺旋形轴体内的螺旋形槽，从所述转子的顶部到螺旋形槽的特定距离随着从所述转子的周缘上或附近的參考点起的角度移位在^位置的范围上连续变化。
12.如权利要求11所述的自动聚焦子系统，其中，随着所述自动聚焦转子旋转，当通过所述ー个或多个螺旋形槽的自动聚焦光已在与所述转子相对于旋转參考点的角度移位相关联的~位置处通过所述螺旋形槽之后，落在所述光检测器上。
13.如权利要求12所述的自动聚焦子系统，其中，由所述自动聚焦子系统将每个记录的光強度映射到所述ー个或多个螺旋形轴体内的所述ー个或多个螺旋形槽的所述^位置， 其中所述自动聚焦光通过所述ー个或多个螺旋形槽以落在所述光检测器上并生成所记录的強度。
14.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，随着所述自动聚焦转子旋转，实现所述自动聚焦子系统光轴的扫描，其中在多个旋转位置处，连同所述旋转位置所对应的所述 ^位置的指示一起记录通过所述转子且落在所述光检测器上的光的強度。
15.如权利要求14所述的自动聚焦子系统，还包括计算子系统，所述计算子系统根据所记录的強度和多个位置计算与最大強度对应的Zd位置。
16.如权利要求15所述的自动聚焦子系统，其中，所述计算子系统根据对应于最大强度的所述^位置计算沿着所述光学仪器的光轴从所述光学仪器的物镜到所述光路上自动聚焦光被反射回所在的点的对应距离。
17.如权利要求16所述的自动聚焦子系统，其中，所述计算子系统以所述自动聚焦转子旋转的频率、计算沿着所述光学仪器的所述光轴从所述光学仪器的所述物镜到所述光路上自动聚焦光被反射回所在的所述点的所述对应距离的连续值。
18.如权利要求15所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦子系统附加地根据沿着所述光学仪器的光轴从所述光学仪器的物镜到所述光路上自动聚焦光被反射回所在的点的计算的对应距离、以及沿着所述光学仪器的所述光轴从所述光学仪器的所述物镜到所述光路上自动聚焦光被反射回所在的所述点的期望距离，计算光轴校正Δ ζ，并将所述光轴校正Δζ传送到所述光学仪器的机电组件以便将沿着所述光学仪器的所述光轴从所述光学仪器的所述物镜到所述光路上自动聚焦光被反射回所在的所述点的距离保持在所述期望距离。
19.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，还包括索引检测器，其在物理索引旋转到接近所述索引检测器的位置时检测所述自动聚焦转子上的所述物理索引。
20.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述光源是激光器。
21.如权利要求20所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦系统包括附加聚焦元件，其将来自所述光源的光聚焦成稍微会聚的自动聚焦光束，以防止来自所述光源的所述光被所述光学仪器的所述光学组件聚焦到样本内尖鋭的点。
22.如权利要求20所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦系统包括附加聚焦元件，其将来自所述光源的光聚焦成稍微发散的自动聚焦光束，以防止来自所述光源的所述光被所述光学仪器的所述光学组件聚焦到样本内尖鋭的点。
23.如权利要求20所述的自动聚焦子系统，其中，所述光源发射的光通过环形光圏。
全文摘要
本发明的实施例旨在提出光学仪器内的自动聚焦子系统，该自动聚焦子系统连续地监视光学仪器的聚焦并调整沿着光轴的光学仪器内的距离，以便将精确且稳定的光学仪器聚焦保持在样本上、样本内、或样本附近的特定点或表面处。本发明的某些实施例相对于嵌入它们的光学仪器的其他组件和子系统的操作异步地操作。
文档编号G03B3/10GK102597841SQ201080049653
公开日2012年7月18日 申请日期2010年10月22日 优先权日2009年10月29日
发明者J·库珀, P·古德文 申请人:应用精密公司